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骨科教程：細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染
細菌培養(yǎng)結果陰性仍然是診斷關節(jié)假體周圍感染的現(xiàn)實挑戰(zhàn)。
從受累的關節(jié)不能分離培養(yǎng)出感染致病菌有多種原因，其中最重要的原因是在獲取培養(yǎng)標本前應用了抗生素。
可疑關節(jié)假體周圍感染的病人在確定診斷前不應該應用抗生素，在最后一劑抗生素應用后推遲至少2周進行關節(jié)穿刺。
提高培養(yǎng)陽性結果的其它策略包括快速送檢培養(yǎng)標本，組織或關節(jié)液標本放置在適當的培養(yǎng)基、假體進行超聲處理和延長標本培養(yǎng)時間至2或3周。
對翻修前關節(jié)穿刺沒有感染致病菌的病人，臨床征象仍與關節(jié)假體周圍感染相符，在翻修手術時建議最少取3到5塊培養(yǎng)標本。
當標準技術不能確定感染病原體時，生物標記物和分子技術，譬如聚合酶鏈反應鑒定細菌DNA，在未來診斷關節(jié)假體周圍感染可能會起到越來越大的作用。
關節(jié)假體周圍感染是關節(jié)置換災難性的并發(fā)癥之一。雖然關節(jié)假體周圍感染是不常見的并發(fā)癥，據報告在美國發(fā)生率為1-2%，在醫(yī)療保險的人群中膝關節(jié)翻修最常見，而髖關節(jié)翻修是第三種最常見的現(xiàn)象。而且，關節(jié)假體周圍感染的發(fā)生似乎在增加，到2020年預計要超過60,000到70,000人。
關節(jié)假體周圍感染的診斷依賴于詳細的病史和體格檢查結合血清學檢查及放射學檢查回顧。另外，從關節(jié)液的培養(yǎng)或受累關節(jié)獲取的組織中分離培養(yǎng)出感染性致病菌對選擇恰當的抗生素治療是至關重要的，并對預后提供一些見解。
根據肌肉骨骼感染學會最近提出的關于關節(jié)假體周圍感染的定義：從關節(jié)周圍獲取的兩個單獨的組織或關節(jié)液標本中分離出相同的病原體可以確診為關節(jié)假體周圍感染。
然而，在7%至12%的病人中雖然具有明確感染的其它指證，譬如引流竇道或關節(jié)液白細胞(WBC)計數和分類明顯增高，但細菌培養(yǎng)陰性。
細菌培養(yǎng)假陰性不僅對選擇適當的抗生素治療提出了挑戰(zhàn)，而且也經常是病人和醫(yī)生的焦慮之源，因為沒有確定的病原菌醫(yī)生懷疑診斷。對細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染的處理涉及到應用廣譜抗生素或多種抗生素抑制常見的致病菌。
這種處理方法使病人處于機體中毒的風險中，也不能覆蓋抑制真菌或少見致病菌。因此，盡一切努力分離培養(yǎng)出致病菌是關鍵。
關節(jié)假體周圍感染細菌培養(yǎng)陰性的原因
據報告發(fā)生細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染為7%-12%不等。以前的研究凸顯了不能分離出感染性致病菌的潛在原因。最重要的原因是從受累的關節(jié)獲取關節(jié)液或組織樣本前病人使用了抗生素。
Trampuz等的研究結果表明在獲取培養(yǎng)樣本前2周應用抗生素與培養(yǎng)陽性率低相關。關節(jié)假體周圍感染細菌培養(yǎng)陰性的60例病人的其他報告中，Berbari等發(fā)現(xiàn)53%的病人在從受累的關節(jié)獲取培養(yǎng)標本前曾接受抗生素治療。
如果安全的話，在手術干預或培養(yǎng)前終止應用抗生素至少2周，可提高假體周圍組織培養(yǎng)的敏感性;不易生長的微生物培養(yǎng)困難，甚至需要很長的培養(yǎng)時間。
而且，關節(jié)液WBC計數和分類是常用于診斷關節(jié)假體周圍感染具有說服力的檢查，在確診或從關節(jié)獲取關節(jié)液前應用抗生素可影響其準確性。
最后，研究表明關節(jié)置換術后切口引流時間延長(5天以上)也與關節(jié)假體周圍感染病人細菌培養(yǎng)陰性風險增加有關，這很可能因為切口引流應用抗生素所致。
培養(yǎng)技術可能妨礙感染致病菌的確定。關節(jié)假體周圍感染細菌培養(yǎng)陰性的原因之一是傳統(tǒng)組織培養(yǎng)不能發(fā)現(xiàn)包裹在生物膜中的感染性致病菌。
在生物膜中細菌包裹在由大分子譬如多糖蛋白質復合物組成的復雜結構中，這些大分子使致病菌逃避了人體的免疫系統(tǒng)(巨噬細胞和中性粒細胞)。據估計這些固著菌比相應的浮游菌(自由漂浮)耐抗生素1000倍以上。
在慢性關節(jié)假體周圍感染的大部分致病菌存在于生物膜中，粘附在假體表面及其周圍組織中。后者解釋了在這些病人中培養(yǎng)陽性率低，因為細菌培養(yǎng)要依靠分離出浮游菌。慢性關節(jié)假體周圍感染沒有自由浮游菌也解釋了病人缺乏感染體征的原因。
在可疑關節(jié)假體周圍感染的病人不能獲得陽性培養(yǎng)結果的第二個原因是在實驗室沒有應用細菌生長和分離的專門培養(yǎng)基。不典型性致病菌，不能生長在常規(guī)需氧或厭氧的培養(yǎng)基，譬如真菌和結核桿菌，而丙酸菌屬和凝血酶陰性的葡萄球菌需要一至二周的時間進行分離培養(yǎng)。
培養(yǎng)陰性的第三個原因是獲取培養(yǎng)標本和送檢標本的方法。從關節(jié)未感染部位獲取標本，延遲了標本送檢和組織的脫水或極度溫度下的暴露影響了培養(yǎng)的結果。
關節(jié)穿刺物培養(yǎng)陽性率減少的第四個原因是導入了抑菌劑，譬如鹽溶液或局麻藥在抽吸時進入關節(jié)腔。如果在進行穿刺時，沒有獲取關節(jié)液，我們建議在關節(jié)另一部位再次抽吸。在獲取培養(yǎng)標本前術中切開灌洗應用抑菌劑也可干擾致病菌的分離培養(yǎng)。
提高細菌培養(yǎng)陰性病人確定致病菌的策略(表I)
美國骨科醫(yī)師協(xié)會(AAOS)髖膝關節(jié)假體周圍感染診斷的臨床指南強烈推薦反對在可疑關節(jié)假體周圍感染的病人確診前應用抗生素。正如先前面的討論，這是降低關節(jié)假體周圍感染細菌培養(yǎng)陰性的最有效方法。該指南也包含建議從關節(jié)獲取培養(yǎng)物前至少2周停止應用抗生素，但是對于難于培養(yǎng)的一些致病菌可能需要更長的時間。
然而，在翻修手術前區(qū)別應用治療性和預防性抗生素是重要的。很明顯在獲取關節(jié)深部培養(yǎng)物前不鼓勵應用治療性抗生素，翻修手術前給予預防性應用抗生素是細菌培養(yǎng)陰性關節(jié)假體周圍感染的原因之一，其作用還不清楚。
認為常規(guī)應用預防性抗生素作為全關節(jié)置換預防關節(jié)假體周圍感染強有力的手段是公認的標準。然而，傳統(tǒng)的教程建議翻修手術前應該停止這些抗生素的應用，以免影響深部培養(yǎng)物的培養(yǎng)結果。
最近的兩項研究挑戰(zhàn)了這一觀念，提議單劑預防性抗生素不會影響應用現(xiàn)代檢測技術的培養(yǎng)結果。而且在進一步的檢測下我們停止應用預防性抗生素，因為我們術前提高了“確定”或“排除”感染。
特別說明的是，AAOS臨床實踐指南中關于對關節(jié)假體周圍感染的診斷，建議在翻修手術前所有病人測定紅細胞沉降率(ESR)和C反應蛋白(CRP)水平，因為這些檢測具有高度敏感性。
如果這些血清學標記物陰性，關節(jié)假體周圍感染的風險非常低，由于預防性應用抗生素對術中培養(yǎng)物的影響較小，所以停止應用抗生素的風險相比之下可能要大。
同樣的，如果ESR和CRP水平升高，或者臨床感染的可能性增加，術前進行關節(jié)穿刺，絕大多數病人關節(jié)液WBC計數和分類的結果則肯定或排除感染。另外，關節(jié)液的培養(yǎng)結果也可確定診斷和鑒定致病菌。
所以，從獲取的證據表明，不能在無菌狀態(tài)下行關節(jié)翻修的病人和已經確定關節(jié)假體周圍感染的病人，術前已經確定感染致病菌，術前應該接受預防性抗生素。只有強烈懷疑關節(jié)假體周圍感染但是沒有分離培養(yǎng)出致病菌的病人，術前才停止應用抗生素。
就如AAOS診斷關節(jié)假體周圍感染的臨床指南所建議的，在翻修手術時，手術醫(yī)生應該從關節(jié)周圍獲取多個培養(yǎng)物。從髓腔或骨-植入物假體界面獲取組織被認為可分離培養(yǎng)出致病菌的陽性率更高，關節(jié)液或組織直接培養(yǎng)比拭子培養(yǎng)陽性率更高。
用銳性器械自由分離切開而不用電刀切取組織，因為極端熱量可能使組織壞死和干擾感染性致病菌的培養(yǎng)。用清潔器皿裝入組織并直接送檢至培養(yǎng)器皿，不允許標本接觸手套、手術巾或其他物質的表面。后一策略似乎對降低培養(yǎng)假陽性是有效的，確保能培養(yǎng)出真正的感染性致病菌。
培養(yǎng)技術有特殊的規(guī)定。從關節(jié)恰當獲取的組織或關節(jié)液標本，并立即處理。血液培養(yǎng)瓶改善了關節(jié)液標本的微生物檢測，比常規(guī)瓊脂培養(yǎng)基或肉湯培養(yǎng)基降低了污染。接種在血液培養(yǎng)瓶中的關節(jié)液能更快地鑒別出致病菌，敏感性和診斷的特異性更高。
如果懷疑真菌或結核菌感染，需要應用適當的送檢瓶(無菌的螺絲帽培養(yǎng)管，Amies轉運培養(yǎng)基，或Stuart轉運培養(yǎng)基)和分離培養(yǎng)基(Lowenstein-Jensen改良羅氏生長基，Sabouraud瓊脂，或腦心浸液瓊脂)。有些機構也建議對所有培養(yǎng)標本應用富集培養(yǎng)基,譬如含綿羊血的胰酶大豆瓊脂、巧克力瓊脂、McConkey瓊脂或腦心浸液肉湯。
其他提高細菌培養(yǎng)陽性率的策略是延長標本的培養(yǎng)時間至14天或可能21天。計劃保持培養(yǎng)14天的標本，如果不能分離培養(yǎng)出感染致病菌，應該延長培養(yǎng)21天，以便培養(yǎng)出生長緩慢的致病菌，譬如分枝桿菌和一些真菌。
根據培養(yǎng)時間把分離培養(yǎng)的菌群分為兩類：主要存在于培養(yǎng)第一周內的早期菌群和培養(yǎng)第二周檢測到的晚期菌群。雖然一些機構推薦對所有培養(yǎng)標本都常規(guī)培養(yǎng)14天，但是我們相信術前不能確定致病菌的病人經過更長的標準時間培養(yǎng)后是有用的。
超聲處理保留的假體是破壞生物膜暴露感染致病菌和提高細菌培養(yǎng)結果的一種方法。超聲處理增加了致病菌的化學降解，而且破壞了細菌細胞壁的結構和滲透性，顯示能夠保持細菌的活力。
據報告超聲處理比常規(guī)方法具有更高的敏感性。其優(yōu)勢包括在改善致病菌的培養(yǎng)陽性率和藥物敏感試驗方面具有方法簡單、可重復性和有效性。但該方法存在效用性的缺陷。
分離培養(yǎng)感染致病菌新的分子技術
近年在普通分子生物學領域，尤其在生物標記領域取得了巨大發(fā)展。生物標記物是感染致病菌或由感染激活的免疫細胞的副產物。
我們最近報告了應用白細胞酯酶試紙檢測關節(jié)假體周圍感染。白細胞酯酶試驗對診斷關節(jié)假體周圍感染具有100%的特異性和100%的陽性預測價值。這一簡單和價廉的試驗效果是確定的，雖然該試驗受關節(jié)內血液或組織碎片的影響，以至于難以讀出比色色度的試驗結果，或多或少具有主觀性。應用白細胞酯酶試紙可以精確診斷細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染。
對可疑關節(jié)假體周圍感染的病人也有測定關節(jié)液CRP水平或其它生物學標記的報告。應用生物標記替代物的下降不能確定感染致病菌，所以不能進行藥物敏感試驗來指導抗生素的治療。
聚合酶鏈反應(PCR)是一種通過一系列指令擴增DNA，產生成千上百萬的特異DNA復制序列的生物化學方法。作為檢測假體周圍感染的具有潛力的方法得到了獲得了令人興奮的發(fā)展。
根據這一技術是利用種屬特異性引物或寬序列的引物堿基對16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)的PCR擴增。根據PCR分析可產生良好的結果，并且已經建議作為一種消除關節(jié)液培養(yǎng)假陰性率高的可供選擇的方法。
雖然根據PCR分析可提高對細菌培養(yǎng)陰性病例的培養(yǎng)敏感性，但是在實際應用中，由于種種原因這一技術的實際應用還比較受限，包括培養(yǎng)假陽性率較高、技術儀器要求高和費用高。
細胞死亡后或在精制的重組試劑中細菌污染導致細菌DNA持續(xù)存在，推斷極度的敏感可能是結果假陽性率高的最重要原因，因此臨床醫(yī)生不能信奉這一技術。
為提高這一分子技術的特異性和降低假陽性結果，基于PCR技術的RNA得到了應用。理論上講，根據這一方法RNA更具選擇性，原因是RNA不穩(wěn)定易于分解，這主要是與活菌有關。
已有報告稱基于PCR技術，由于測定了非活性基因組DNA，應用信使RNA(mRNA)幾乎能消除產生的假陽性結果。然而，臨床標本細菌中mRNA轉錄量少(低于RNA總量的1%)，并且細胞死亡后mRNA降解率高，限制了該技術的應用。
相反，推薦應用基于PCR的rRNA的技術，由于其優(yōu)越性，包括細菌rRNA成出量高(大于RNA總量的95%)、特異性接近100%和相當于術中培養(yǎng)的敏感性。已經開發(fā)了特異性靶點耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)的mecA基因，產生了令人鼓舞的結果。
最近我們應用了生物感應器Ibis T5000(卡爾斯巴德，加利福尼亞)，它是基于PCR技術的多重聚合酶鏈反應，它應用了多重種屬特異性的引物而不是通用引物來擴增某一細菌的基因，以提高細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染的診斷，從而確定感染的致病菌。
應用這一技術確定耐藥基因可在下列病人中進行鑒別：感染和培養(yǎng)陽性結果、感染和細菌培養(yǎng)陰性、關節(jié)假體周圍可疑感染而沒有感染。
另一項有趣的技術是PLEX-ID (伊利諾斯州，Abbott實驗室)，最初是根據類似電噴射打靶技術，從3100種已知細菌的標本中來確定感染的致病菌。該裝置利用高分辨亞型和耐藥譜能確定感染致病菌的特征，包括耐甲氧西林特性的mecA基因。
細菌培養(yǎng)假陽性
雖然關注了細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染，但是診斷細菌培養(yǎng)假陽性的關節(jié)假體周圍感染同樣重要。就如先前概述的一樣，有些人認為傳統(tǒng)培養(yǎng)是診斷的所謂金標準，這有很大的缺陷。
為了降低細菌培養(yǎng)假陽性結果的風險，處理要培養(yǎng)的組織標本至關重要。尤其是術中應用清潔器皿獲取的標本要直接放于無菌的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)杯，而不接觸手套、手術巾和隔離衣。
在臨床醫(yī)生沒有考慮現(xiàn)有的其他診斷情況下，而病人的培養(yǎng)結果不能解釋，認識到這一點很重要。AAOS臨床指南強烈推薦：如果血清學檢查不正常，翻修手術前要進行關節(jié)穿刺，因此大部分關節(jié)假體周圍感染的病人術前應該確診。
特別說明的是，如果ESR和CRP都正常，培養(yǎng)結果陽性或可疑，那么感染的風險很低。而且，如果血清學檢查不正常，術前要進行關節(jié)穿刺，臨床醫(yī)生要進行關節(jié)液WBC計數和分類(就和術前培養(yǎng)一樣)。如果全部檢查都陰性，感染可能性就不大。
假體周圍組織的組織病理學檢查是診斷關節(jié)假體周圍感染的另一種很有價值的工具，并且有助于臨床醫(yī)生適當考慮培養(yǎng)假陽性的可能。而且，AAOS臨床指南強烈推薦術中要進行多次培養(yǎng)。
如果能進行三到五次的培養(yǎng)，則能極大地幫助解釋培養(yǎng)結果，特別是對于僅有一次培養(yǎng)陽性，而其它次培養(yǎng)陰性。最后，疾病感染專家對幫助確定培養(yǎng)是否假陽性具有不可估量的價值。
細菌培養(yǎng)可疑陰性的關節(jié)假體周圍感染病人的實用方法
臨床醫(yī)生在面對病史、體格檢查、血清學結果和關節(jié)液分析都提示感染的病人時，但是術前穿刺培養(yǎng)初次陰性，以下步驟可能是有幫助的。
首先，重新進行關節(jié)穿刺，同時確保病人至少兩周沒有應用抗生素。送檢獲取的關節(jié)液進行有氧和無氧培養(yǎng)，同時進行真菌和抗酸桿菌的特異性培養(yǎng)。穿刺的關節(jié)液也應送至血液培養(yǎng)瓶。標本應直接送至實驗室并且根據瓶條進行迅速處理標本。
外科醫(yī)生要和微生物實驗室進行溝通，實驗室經常由感染疾病專家指導，可進一步指導幫助延長培養(yǎng)(14天至21天)，可能建議特殊培養(yǎng)基。最后，臨床醫(yī)生應始終仔細探問旅游或居住在致病菌流行區(qū)病人的詳細病史，可能會暗示非典型致病菌的感染，譬如球孢子菌感染。也應該進行血液檢查確定該致病菌的存在。
如果進行了上述所有檢查，翻修術前仍然沒有檢測出致病菌，術前應該咨詢疾病感染專家。這要考慮病人由其他專家進一步確定診斷，允請感染疾病專家不僅是術前通曉告知病例(有助于抗生素的選擇)，而且也有助于指導術中獲取的培養(yǎng)物的處理。
細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染的病人翻修手術時，要在全身應用抗生素前在高度懷疑的感染區(qū)域切取3至5塊組織標本進行培養(yǎng)。切取的組織標本如上所述以應急的方式進行處理。如果可能的話對保留的假體應該進行超聲處理。五塊組織標本應該作為永久切片保存進行組織病理學分析以進一步確定關節(jié)假體周圍感染的診斷。
因此，細菌培養(yǎng)陰性的關節(jié)假體周圍感染對臨床醫(yī)生和病人提出了挑戰(zhàn)，可能占關節(jié)置換感染病人的10%。對這些病人中不能應用針對性的抗生素治療感染性致病菌，必須進行廣譜抗生素的治療，此時多種抗生素的應用增加了病人全身毒性的風險。
有多種原因不能從受累的關節(jié)中分離培養(yǎng)出感染致病菌，其中最重要的原因是在獲取深部培養(yǎng)物前應用了抗生素。另外的原因是傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)不能獲取包裹在生物膜中的感染致病菌，當懷疑非典型性病原體譬如真菌和結核桿菌，而沒有應用特異性培養(yǎng)基來接種和分離。
AAOS臨床指南指出，關節(jié)假體周圍感染可疑病人在診斷確定或排除前不能應用抗生素。另外，在應用最后一劑抗生素至少2周后推遲進行關節(jié)穿刺。
高度懷疑關節(jié)假體周圍感染，如果存在細菌培養(yǎng)陰性和穿刺沒有陽性結果及炎性標記物升高，應該進行關節(jié)重復穿刺。應用多種策略提高培養(yǎng)的陽性率，包括迅速送檢培養(yǎng)標本，在無菌狀態(tài)下培養(yǎng)，把組織或關節(jié)液放在適當的培養(yǎng)基，延長標本的培養(yǎng)時間，對非典型性致病菌譬如真菌和結核桿菌應用富集和特異性培養(yǎng)基。尋求感染疾病專家的幫助也具有不可估量的作用。